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挽幕斋

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日志

 
 

高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法  

2010-05-14 13:57:24|  分类: 药物分析 |  标签: |举报 |字号 订阅

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1 色谱柱跑干了,处理方法:将贮液瓶装入重蒸水,首先按purge键,将柱前气柱排出,若无法排出,可将色谱柱前拆下,用注射器抽吸。待柱前气体排空后,连接色谱柱,用水高低流速交替冲洗色谱柱,直至柱压稳定为止。

2.基线不稳,有静电,处理方法:检查接地是否良好。

3.峰面积变化非常大,处理方法:检查是否进样阀堵塞。

4.基线突然提高,变粗,处理方法:检查样品池能量,若低于正常值,说明检测器污染。

5.柱压变动范围较大,处理方法:多为进气泡。高低流速交替冲洗。

6.柱效或峰形突然变差,处理方法:更换预柱。

7塔板数低 :色谱柱选择不对,二次保留、峰形不好的影响

8色谱柱易变性:色说柱选择不对,二次保留的影响

9色谱柱寿命短:色谱柱选择不对,样品需预处理(PH<3或PH>7)

10保留值变化:色谱柱平衡不够,流动相比例改变

11出现新的干扰峰:初始分离不够或初始样品无代表性

 

选择波长要从以下几个方面考虑:

 

1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后,基线抬高,减小检测的线性范围而且会加大基线噪声,对溶质的检测灵敏度下降。

2. 对各组分都要有适当的吸收。一般是不可能做到的。所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。

3. 外标法定量时,要选择被测组份最大吸收波长。

254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。对饱和基团也有弱的吸收。而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。

(一)涡流扩散(Eddy diffusion)

流动相碰到较大的固体颗粒,就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀,有的部分松散或有细沟,则流动相的速度就快;有的部位结块或装直紧密则流就慢,多条流路有快有慢,就使区带变宽。因此,固相载体的颗粒要小而均匀,装柱要松紧均一,这样涡流扩散小,柱效率高。

(二)分子扩散(Molecular diffusion)

分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动,也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时,如果流速太慢,被分离物质停留时间长,则扩散严重。

(三)质量转移(Mass transfer)

被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时,转移速度慢,来不及达到平衡动相就向前移,这各物质的非平衡移动,使区带变宽。

四)动相流速

当流速太低时,分子扩散严重,特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图,理论塔板高度随流速增加而急速下降,当达到最低值时,流速再加大则质量转移起主要作用,理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中,流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中,因为物质要渗透到凝胶内部,所以质量转移影响大,流速咖大会降低柱效率。

五)固定相颗粒大小

定相颗粒越小柱效率越高,对流动相流动的阻力越大,需要加大压力才能使它流动。

1、开泵后压力即升高至最高限度,经过对色谱柱前,色谱柱,色谱柱后的分段测试,确定为检测池堵塞。

2、换检测波长后,色谱峰面积比以前做的小很多,怀疑进样环或管路漏夜,经检查,排除,最后确定为,检测波长的显示值和实际值不符。

由气味、景象和声音可以发现的问题

你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如:在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。

A、溶剂的气味

原 因         解决方法

1、漏液 1、见前

2、溅出 2、a、检查废液瓶是否已满 b、找到溅出的部位并清洗干净

B、热气味

原 因                 解决方法

1、仪器过热 1、a、检查并调节通风设施 b、检查并调节温度设定

c、关掉仪器,查找维修手册

C、读数不正常

原 因                   解决方法

1、压力不正常 1、见前

2、柱温箱问题 2、a、检查并调节设定 b、参照用户手册

3、检测器灯失效 3、更换灯

D、灯警告

原 因                   解决方法

1、压力超出极限值 1、a、检查是否阻塞 b、检查并调节极限值的设定

2、其它警示灯 2、见用户手册

E、警告音

原 因                   解决方法

1、溶剂泄漏/溅出 1、找到并解决

2、其它警告音 2、见用户手册

F、刺耳的短音或长音

原 因                  解决方法

1、轴承失效         1、见用户手册

2、润滑不够         2、进行恰当的润滑

3、机械故障         3、见用户手册

进样阀可能发生的问题

A、手动进样阀,转动不灵

原 因           解决方法

1、转子密封损坏   1、更换或调整转子密封

2、转子太紧      2、调整转子的松紧度

B、手动进样阀,载样困难

原 因           解决方法

1、进样阀安装不当          1、重新安装

2、定量环阻塞              2、清洗或更换定量环

3、进样器污染              3、清洗或更换进样器

4、管路阻塞                4、清洗或更换管路

C、自动进样阀,不能转动

            原 因                   解决方法

       1、无压力(或电源)   1、提供恰当的压力(电源)

       2、转子太紧           2、调整转子的松紧度

       3、进样阀安装不当     3、重新安装

D、自动进样阀,其它问题

     原 因                     解决方法

           1、阻塞         1、清洗或更换阻塞部件

           2、机械故障     2、见随机维修手册

           3、控制器故障   3、维修或更换控制器

HPLC柱压过高:

1.拆去保护柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;

2.把色谱柱从仪器上取下来,如果压力仍然不降,则是管路堵塞,须清洗,如果压力下降了,将柱子的进出口反过来接再仪器上,用10倍量柱体积的流动相冲洗柱子,如果柱压仍不降,再检查

3.更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明溶剂获样品中含有固体颗粒,若柱压还高,可在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器

 

基线不稳,上下波动或漂移

1。流动相有溶解气体;用超声波脱气15-30分钟

2。单向阀堵塞,取下超声去除堵塞物

3。泵密封损坏,造成压力波动,更换泵密封

4。系统存在漏液点,确定漏液位置并维修

5。流通池内有赃物或者杂质,清洗杂物

6。柱后产生气泡,流通池出液口加负压调节器

7。检测器没有设定在最大吸收波长处

8。柱平衡慢,特别是流动相发生变化时。用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的心流动相对柱子进行冲洗

 

1.检测信号出现倒峰,检查检测器与主机相连接是否有松动,可以把下重新连接。

2.夏季气温高,水容易生菌,要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。

3.由甲醇换到流动相平衡时,压力先稍稍下降,然后慢慢回升,可能是混合池混合效果不好,也可能是B泵轻度堵塞。

4.色谱柱长期不用,应用甲醇冲洗2h以上后,宁上两端螺丝保存。

 

岛津机器易出现的毛病是:

1、压力不稳:单向阀堵塞,可拆下,用甲醇水超声; 或漏液; 管路过滤器损坏;

2、基线噪音变大:未接地线,可在检测器的外壳外接一根铁丝连地; 灯能量不足,可在funk功能中查找灯的使用时间,或拆开机器外壳,观看紫外灯的强度; 检测池污染,拆下柱子,用无体积连接器连接泵和检测器,用异丙醇小流速冲洗半个小时即可; 流动相污染或进气泡。

3、泵头有盐析出:应经常用5%异丙醇清洗柱塞杆,否则易磨损。4、进样口漏液:可能是标准针头变形或损坏,使得进样器磨损,不好的针头应及时扔掉。

位同仁,为保证我们的分析效果,延长色谱柱的使用寿命,大家一起来贡献一下自己在色谱柱使用过程中的护柱秘诀吧。


我先来聊聊,算是抛砖引玉了

1、最好用预柱。(但要注意,若有时出峰异常,要先看看是不是它有问题了)

2、每次做完分析,都要进行冲洗,

分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质,建议用90%甲醇冲洗30~60min;

若分析用流动相中含以上物质,要先用10%甲醇(或用与分析用流动相同比例,把含酸、碱、盐溶液换成水)冲洗1小时左右,再梯度走到90%甲醇冲洗30~60min(若用多元泵)。有必要时再循环几次,可以适当缩短时间。

若长时间不用该色谱柱,要冲洗好后,用纯甲醇或乙腈封存。

3、若流动相中用到离子对试剂,更应该好好冲洗,且该色谱柱最好作为专用,不能再做其它物质分析用。因色谱柱填料性质已与原来所不同,在该柱上所摸索的色谱条件,可能在其它同类柱子上得不到重现。

4、尽量避免反冲,除非该色谱柱厂家明确说明允许。

5、普通C18柱尽量避免在40℃以上的温度下分析。

6、定期测柱效,有下降,可以用10%异丙醇甲醇冲洗色谱柱。若柱效还没有改善,可以再生,甲醇-二氯甲烷-甲醇。

呵呵,还有的一时想不起来了,各位有经验的战友请发表高见!


1.样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤,流动相采用0.45μm滤膜过滤并脱气。

2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围

3.避免流动相组成及极性的剧烈变化。

4. 避免纯水冲洗反相色谱柱。

5.每次测试完毕,要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱(分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml)。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕后将柱子用纯水冲洗干净,并保存于乙腈中。

6.压力升高是需要更换预柱的信号。


 

helen_gu wrote:

1.样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤,流动相采用0.45μm滤膜过滤并脱气。

2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围

3.避免流动相组成及极性的剧烈变化。

4. 避免纯水冲洗反相色谱柱。

5.每次测试完毕,要用20倍柱体积的流动相冲洗色谱柱(分析色谱柱250×4.6mm柱体积3.2ml)。如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕后将柱子用纯水冲洗干净,并保存于乙腈中。

6.压力升高是需要更换预柱的信号。

避免流动相组成及极性的剧烈变化。是不是流动相组成改变时要有个梯度,缓慢升或缓慢降?那要多慢呢,比如说我用水和乙腈做流动相,想从20:80升至100:0,设定多长时间比较合适呢

另外,纯水冲反相柱的缺点是什么呀?

请多指教,谢谢了


说说防止色谱柱堵塞的问题吧:

1:溶剂中的不溶物—应使用色谱纯溶剂,膜过滤(孔径不超过0.45μm)

2:样品中的不溶物—应对样品进行膜过滤(孔径不超过0.45μm)

3:泵,进样器等中的不溶物—在泵和进样器之间安装内置过滤器,在进样器和柱之间安装预过滤器

4:柱内不溶物的形成:由于溶剂的不互溶而产生的沉淀—用能溶解沉淀物的溶剂冲洗色谱柱;在不互溶溶剂中由于进样而产生的沉淀—检查样品液和流动相是否互溶;由于温度的改变或固定相的干涸而产生的沉淀—将色谱柱密封紧,并保持室温恒定!

还有就是平衡色谱柱、色谱柱的再生:

1 平衡色谱柱:反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。

  硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

如何平衡色谱柱?

  平衡过程中,将流速缓慢地提高;用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂浓度如果较低,则需要较长的时间来平衡)

2 色谱柱的再生:进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱!


偶也来参与一下,谈一点拙见

1.对于一些特殊型号的柱子,例如不同型号的手性柱应严格按照柱子的相应说明书所要求的进行维护,并按照其规定的范围选择试剂的种类,比例,PH ,等等;

2.尽量避免柱子进气泡的现象出现,如在实验 过程中留心流动相的体积,同时对所需体积进行大概的估计,以免吸空,气泡进柱,尽管有多种排气泡的方法,但毕竟影响柱子的性能,尤其是比较“娇贵”的柱子;


每天用足够的时间来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得最大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!------ 一定得做!

  新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试,即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。

卡套柱的安装(不加预柱) 1.将卡套架套入柱芯

2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使柱芯高于夹套(见左图)

3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片

4.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧

5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

6.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手

注意:使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。

卡套柱的安装(加预柱)

1.将卡套架套入柱芯

2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯(见左图)

3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片

4.将"子弹头"预柱放入卡套片内

5.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧

6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

7.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手

更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱)

注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。

1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端

2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中,并顺时针方向旋转到旋紧

3.一手握柱芯,另一只手轻轻地向外拉3,取出柱芯顶端的滤网

4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料

5.将新的填料用甲醇润湿,然后填入挖去的部位,压平

6.照(左图)装上新的玻璃棉滤网,并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端

7.柱芯顶端套上2,然后参照(左图)将滤网放入

8.压紧,然后取下2,再用4将滤网的边缘压平

平衡色谱柱  反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。

  硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

如何平衡色谱柱?

  平衡过程中,将流速缓慢地提高

  用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡)

色谱柱的再生   进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

表1 建议用来冲洗的溶剂体积

色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积

125-4 1.6ml 30ml

250-4 3.2ml 60ml

250-10 -20ml 400ml

请根据下表选择您的再生方法:

极性固定相(如Si,NH2*,DIOL基色谱填料)的再生:

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的再生:

水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水

0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

注意:

在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护

1.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)

2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围

3.避免流动相组成及极性的剧烈变化

4.流动相使用前必须经脱气和过滤处理

5.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存大乙腈中

6.压力升高是需要更换预柱的信号


对于高效液相色谱柱的保护我也来谈谈吧。

1.首先,溶剂、样品要前处理,溶剂要用色谱级别的并用0.45um的滤膜过滤并脱气,样品要用0.22um的滤膜过滤。

2.做样前,柱子要平衡一段时间,先用甲醇平衡30-60分钟,再用纯化水平衡30-60分钟,然后用流动相平衡,直到基线走平时,再进样。

3.做样结束后,柱子要用甲醇和水冲洗,冲洗顺序与2步相反,最后柱子用甲醇(95%)保存。

4.如果柱子里东西太多,可以用甲醇,乙腈,水反复冲洗。


谈谈关于启用新柱子(C18)的注意事项:

1、首先应检查一下,看是否为原装产品和外观完好情况。

2、保存好供应商随柱提供的“关于柱性能测试报告”,其中包含了新柱子的最佳性能指标,如在某预定色谱条件下的柱压、柱效等。

3、重现流动相条件,主要观察柱压的变化(100%甲醇、100%乙腈、50%甲醇-50%水等),并将数据记录在“性能报告上”,以便今后对照。

4、启用新柱子时的流动相流速应慢一点,如0.3-0.5ml/min,经过10-15min后可以加快。

5、对于25cm柱子,流速一般不超过1.0ml/min,能用慢速流量时尽量使用慢一点,当然要考虑分离效果和分析时间。


加预柱喽!


以上大家都说了很多柱子保护方面的内容,已经很全了,但我想补充一个方面:用离子对色谱法时柱子使用的一个问题.我们知道,一般我们分析样品时,常采用有机相(甲醇,乙腈)-水体系作为流动相,对于大部分的分析工作,这个体系就能胜任了,但是,当我们遇到弱酸碱时,比如生物碱,容易拖尾,这时候我们可以采用离子对色谱法进行分离,常用的离子对试剂有庚烷磺酸肭和十二烷基磺酸钠,这时候,我们常采用pH3-5的缓冲盐体系,我们在 采用离子对色谱进行分离时,该怎么保护色谱柱呢?一个很重要的问题是,当我们冲柱子的时候,应该先采用有机相-水体系冲,再用水冲,然后用有机相冲,比如我们的流动想是甲醇-0.5%的庚烷磺酸钠(pH3.3)(50:50),我们在冲柱子的时候,应该先用50%的甲醇水冲柱子,然后用水冲,然后用甲醇冲,这是为什么呢?我们知道,通常的洗衣粉的主要有效成分是十二烷基硫酸钠(表面活性剂),它可以把一些脂肪油洗下来(烷烃及其衍生物),庚烷磺酸纳也是表面活性剂,如果先用水冲洗,会产生用洗衣粉洗衣服时的效果(ODS的固定相是长链烷烃),会造成固定相的损失,如果我们采用有机相-水体系先冲柱子,由于表面活性剂在有机相中有一定的溶解度,并且流动相的量比较大(相对于固定相,因为流动相是在不停的流动嘛)会使表面活性剂逐渐溶解在流动相中而被冲出,当表面活性剂被冲干净之侯,我们就可以采用水冲,然后采用有机相保存柱子了.


我也说说色谱柱的保护

首先要看清楚说明书,是属于何种色谱柱,楼上各位所说都是集中在反相柱上,而正相色谱柱的保护和处理则有很大不同

其次,色谱柱优良好坏的指标有柱效、柱压等如果在实验的某一天突然发现柱压升高,或者峰形脱尾等现象,则有必要对色谱柱进行处理。处理方法,反相柱楼上的已经说了很多

第三,色谱柱在进样时一定要过滤,最好加上预柱

再附上一篇英文的色谱柱保护方法

colcare.pdf (100.25k)


我们的液相,既没有在线流动相过滤器,也没有预柱,(可能是经济原因不给配),所以,做样都要万分小心,但是,柱压还是会莫名其妙的升高。从最初的100%甲醇600psi慢慢到最后1800psi,这个时候可能就是柱子堵了,但是出峰时间和柱效(踏板数)几乎没有什么变化。

一般情况我们的处理办法是,将柱子用甲醇饱和后,将柱子竖直放置,进口端的方向竖直向上,用两个扳手慢慢将柱子的入口端螺丝拧下,这时,会看到白白的硅胶,有时候会看见一个薄薄的筛板,将拧下的螺丝和筛板进行超声清洗,螺丝只需用100%甲醇或者100%乙醇和水超声即可,筛板需要先用水,再用20%硝酸(15分钟以上),再用异丙醇超声,其他的超声10分钟左右就行。

如果筛板和螺丝是一体的,那么就不能用那么高浓度的硝酸了5%既可了。

开口的硅胶在空气中放置1个小时以内是没有任何关系的,当超声完毕后,按照原来的样子重新安装上就可以了。然后再用甲醇饱和。

我的长柱子25cm和短柱子15cm的我都拆开清洗过筛板,效果非常明显,压力从2200psi(25cm)下降至900psi,1800psi(15cm)下降至700psi。

经过全部检查确定压力增大是由柱子引起的可以一试。


本人不才,看了楼上各位的高见!也斗胆在这里谈谈自己的一些管见!望各位

多多指教!通常我们使用得较多的柱子都是反相柱,所以在这里我就只谈反相

硅胶柱的一些清洗方法:

清洗硅胶键合柱子

再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的,利用简单的步骤来除去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时候,经过多次操作以后的色谱柱用90~100%的溶剂B(双溶剂反相系统中较强的溶剂)冲洗20个体积可以清除污染物。(表2列举了不同规格的HPLC柱子的空体积,因此读者能方便地确定相应柱子冲洗的体积。)例如,柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲液系统,不要直接切换到强溶剂,突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀,这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相(即把缓冲液换成水)。冲洗5~10个体积以后才更换强溶剂。

有时候,强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是一系列溶剂就有必要用来清洗柱子乐,如果污染物是非生物物质,使用者可以跳过一个或多个另外的有机溶剂去除污染物。溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。

一般来说,所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加,经常最后一个溶剂是非常疏水的(如醋酸乙酯甚至是烃),可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时,必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如,异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂,因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大,必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然,如果使用紫外检测器的话,避免溶剂在紫外区域有吸收,要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。

对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列:

100%甲醇

100%乙晴

75%乙晴-25%异丙醇

100%异丙醇

100%二氯甲烷

100%正己烷

用二氯甲烷或正己烷以后,由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗10个柱体积。如250mm×4.6mmHPLC分析柱,分析者可以用1~2ml/min的流速来冲洗,要回复原来的溶剂体系,不需要每一步都冲洗,可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇,然后用没有缓冲的流动相,最后回复起始流动相配置。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染的溶剂。如果使用者怀疑柱子被严重污染,可以二甲基亚砜(DMSO)或者二甲基甲酰铵和水按50:50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程,溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作。

还有一个问题是清洗过程中是否可以把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的污染物都会累积在柱头,把柱子反过来可以缩短污染物被冲出柱子的移动距离。考虑到装填柱子的稳定性,现在大多数HPLC柱子都是比普通操作压力大很多的高压装填的,因此他们的柱床应该不会受到反方向流速的影响。但是,如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。例如尾部烧结的孔径是2μm,他通常能够留住平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以避免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时,有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱,这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志建议的流动方向,我建议通过操作手册和说明书,厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。无论你是否把柱子反方向,最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池,否则有可能引起污染。

清洗柱子频率主要看有多少强保留物质被打入色谱柱。因为反相柱有时候在分辨率消失或者鬼峰出现前能承受很大的污染,使用者经常会等到出现了异常情况才开始注意。然而,污染物过多的累积会导致清洗柱子的难度加大。所以,如果你知道经常用杂质较多的样品上样时,我建议你们有规律地清洗柱子,你越是频繁清洗柱子,就清洗起来就越不费劲。


我觉得应该将所有注意事项条例化,这样比较简明,下面是我的个人观点:

1. 采用预柱或保护柱

2. 要注意样品的前处理,如果是脏样品,例如中药提取液,体液等,就需要采取萃取等操作除去对柱子损坏较大的杂质,例如色素、多糖、蛋白质等

3. 用0.45um的膜过滤流动相和样品

4. 确保流动相pH在2~8之间

5. 在用含缓冲液或者酸性较强的流动相时,分析完后要用水冲洗,再用纯有机溶剂(最好是乙腈)冲洗

6. 防止柱子干瘪,避免色谱柱受到强烈震荡

7. 定期对色谱柱进行清洗,吸取残留的杂质,并对柱效进行测定

8. 对每种样品最好采用专用色谱柱

9. 避免突然改变流速,也就是流速的改变要平缓


流动相每天的需要很大的,都用0.45um的膜不是很慢而且不经济啊


我的流动相是甲醇和水按2比3的比例混合的,开始几天每天做完后都是先用双蒸水先冲30min,然后用甲醇冲30min,接着就保存在甲醇里到第二天再做.柱子是新的ODS碳18柱子,今天老师告诉我不要冲太久,否则会把固定相上面的固定液冲走损害柱子,因为没有加其他盐类,所以可以不冲太就都可以了,那我怎么清洗柱子呢


 

hu_2104411 wrote:

我的流动相是甲醇和水按2比3的比例混合的,开始几天每天做完后都是先用双蒸水先冲30min,然后用甲醇冲30min,接着就保存在甲醇里到第二天再做.柱子是新的ODS碳18柱子,今天老师告诉我不要冲太久,否则会把固定相上面的固定液冲走损害柱子,因为没有加其他盐类,所以可以不冲太就都可以了,那我怎么清洗柱子呢

直接用甲醇冲洗。


 

hu_2104411 wrote:

流动相每天的需要很大的,都用0.45um的膜不是很慢而且不经济啊

那并不是不经济,因为膜还是很便宜的,而一根柱子的价格可是2000~3000元,如果是一些特殊的柱子,就更贵了,例如灌注色谱、高效排阻色谱柱、手性分离柱等,所以还是不要怕麻烦,这样会给以后的实验带来很大的好处。


1、 注意正确地使用和存放色谱柱,不锈钢柱色谱柱可选用以下的溶剂保存:正相柱用烃类溶剂,反相柱用甲醇,离子交换柱用水或甲醇/水。某些专用分析色谱柱要注意制造商规定的保存条件。另外,要注意溶液的PH值,一般控制在PH2-8范围内,其硅胶柱PH>8时会发生硅胶溶脱的情况,键合型柱PH<2时会发生键合相断裂。

2、 色谱柱污染后可采用合适的溶剂冲洗,使柱效再生。

⑴硅胶柱可以使用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水按顺序冲洗色谱柱,经过净化的色谱柱必须进行水活化,即按上述相反的顺序冲洗。柱再生时所需要的有机溶剂要严格进行脱水处理。

⑵反相柱可以用甲醇、氯仿、正庚烷冲洗,键合C18柱一般用甲醇冲洗,必要时可用0.5 M EDTA钠盐溶液冲洗,然后用水冲洗,以达到去除柱内盐类。

⑶键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。

3、 对污染严重的色谱柱在冲洗无效时,需将柱内填料取出进行处理或更换新的填料,还可以用更换柱头填料的方法即将柱头入口处的被污染的填料取出,重新补装和柱内同类型的填料,然后在改变柱流向进行再生。这种逆流再生柱的方法,可以救活大部分柱子。

4、 注入色谱柱的溶剂、标液、样品溶液都必须严格过滤,以去除杂质,防止堵塞色谱柱。当用反冲洗方法无效时,可将柱口过滤装置取下,用弱酸溶液处理,去除污物或定期更换。

5、 建议:为了保护色谱柱,避免给分析带来不必要的麻烦,请使用保护柱!


1.流动相中含缓冲盐的最好新鲜配制。

2.流动相的水也最好用新鲜的,而且要放在棕色瓶中。


要注意流动相中的磷酸盐与甲醇混合时要注意其比例,否则可能异致磷酸析出,堵塞柱子。


我觉得关于柱子的保护除了加预柱,流动相和样品要过滤之外,很重要的一点是实验后柱子冲洗.冲洗液应该按柱子的说明进行.我在工作中发现:盲目的使用冲洗液,即使冲洗的时间很长,柱子的寿命还是很短.而根据柱子说明书中不同流动相使用不同的冲洗液进行冲洗,能使柱子的寿命延长.在进行柱子的再生时也是如此.


说说新手容易出错的地方!

1、用完柱子后不冲柱子。

2、用完柱子后两端没封口。

3、堵柱子后不管三七二十一就反冲。

4、只要柱效不够就要买新柱子,不看是否有挽救措施。

5、流动相含有机相用水系膜过滤。

6、片剂溶解离心后不过滤。

7、PH不测定就开始冲柱子。

8、拧柱子时用劲太猛,导致接口塞在柱口。

上面的情况大家可否遇到过!


"要注意流动相中的磷酸盐与甲醇混合时要注意其比例,否则可能异致磷酸析出,堵塞柱子。 "

想请教有什么具体要求?


"要注意流动相中的磷酸盐与甲醇混合时要注意其比例,否则可能异致磷酸析出,堵塞柱子。 "

想请教有什么具体要求?


其实最好的是参照色谱柱生产厂家的推荐方案,别的意见只能作为平时的参考,作到心里有数!


针对普通的反相柱的冲洗,就我经验来谈几点吧:

一般要做好一下几点:

1.保证样品内尽可能的澄清,具体方法:

1.1过0.45um微孔滤膜;

1.2有些样品很难滤过:我遇到过这种情况,我采用的方法是将样品放冰箱静置1天,然后在过0.45um微孔滤膜,结果并不影响试验;

2.就是具体进样的时候:中药的话一般最好采用预柱;化药不用也行的;

3.柱子的冲洗了:

3.1如果流动相有盐或者离子对的话先用纯水冲洗30~60分钟的样子,然后从低浓度冲到高浓度,最后用甲醇饱和就ok了,时间一般在60~90分钟就行了

3.2如果流动相没有盐或者离子对的话就直接从低浓度冲到高浓度,最后用甲醇饱和就ok了,时间一般在60~90分钟就行了。

4.就好多人说:不要用纯水冲洗,我认为并不一定的,可以用水,但是不要采用高流速这是真的,我的试验一直是采用纯水的,结果没有什么问题。


我现在在做一个新的化合物,用一般的C18柱分不开,但能略微的看到是有两个峰,调流动相和流速都分不开,我想换柱子,但不知道用什么柱子好呢?


shaoshen :离子对试剂是很难被“逐渐融解在流动相中重干净”的吧?!它和C18之间的作用不能简单的理解为表面活性剂与C18的作用吧?!(唉~距离你的发言两年了~)


 

xiaolan2148134 wrote:

我现在在做一个新的化合物,用一般的C18柱分不开,但能略微的看到是有两个峰,调流动相和流速都分不开,我想换柱子,但不知道用什么柱子好呢?

“一个化合物”还要跑出几个峰啊?做破坏实验吗?跑梯度了吗?


我觉得目前国内在分离度改善方面更多的是改变流动相,而国外更专注于选择柱子.我想可能是经费方面的问题吧.

目前,Waters和安捷伦,HP有一系列针对不同物质和结构的柱子,建议选择其中一种多研究分析.我曾成功地用普通C18柱在20分钟时分离手性物质(流动相是甲醇-水体系),所以遇到分离不佳可以考虑根据结构选柱子,而非改流动相.

具体的各公司网页和产品说明说中有.


若柱子使用的时间较长,柱压较高时,可采用柱子再生法处理,即按水-甲醇-四氢呋喃-二氯甲烷-四氢呋喃-甲醇-水的顺序来冲洗柱子,以达到提高柱子的柱效和寿命


谢谢上面的,让我增长见识了


色谱柱是液相色谱的心脏部件,它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限,故金属管用得较多。一般色谱柱长5~30cm,内径为1~5mm,凝胶色谱柱内径3~12mm,制备往内径较大,可达25mm 以上。一般在分离前备有一个预柱,前置柱内填充物和分离柱完全一样。

柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到最佳效率,除柱外死体积要小外,还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

2.1 液相色谱柱的结构

色谱柱由柱管、压帽、卡套(密封环)、筛板(滤片)、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成,压力不高于70 kg/cm2时,也可采用厚壁玻璃或石英管,管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效,减小管壁效应,不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度,其效果与抛光相同。还有使用熔融硅或玻璃衬里的,用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板,是烧结不锈钢或钛合金,孔径取决于填料粒度,目的是防止填料漏出。

柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压环用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。

在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。

2.2 色谱柱分类

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:

①常规分析柱(常量柱),内径2~5mm(常用4.6mm,国内有4mm和5mm),柱长 10 ~ 30cm;

②窄径柱(narrow bore,又称细管径柱、半微柱semi-microcolumn),内径1 ~ 2mm,柱长10 ~ 20cm;

③毛细管柱(又称微柱microcolumn),内径0.2 ~ 0.5mm;

④半制备柱,内径>5mm;

⑤实验室制备柱,内径20 ~ 40mm,柱长10 ~ 30cm;

⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定,目的是为了避免管壁效应。

2.4 柱的填充和性能评价

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外,还与填充技术有关。在正常条件下,填料粒度>20μm时,干法填充制备柱较为合适;颗粒<20μm时,湿法填充较为理想。填充方法一般有4种:①高压匀浆法,多用于分析柱和小规模制备柱的填充;②径向加压法,Waters专利;③轴向加压法,主要用于装填大直径柱;④干法。柱填充的技术性很强,大多数实验室使用已填充好的商品柱。

必须指出,高效液相色谱柱的获得,装填技术是重要环节,但根本问题还在于填料本身性能的优劣,以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。

无论是自己装填的还是购买的色谱柱,使用前都要对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下(样品、流动相、流速、温度)下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性,或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时,还要注意柱外效应是否有变化。

一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数,如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。

2.5 柱的使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。

在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。

1 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。

2 应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然,流动相使用前必须经脱气和过滤处理

3 一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

4 选择使用适宜的流动相(尤其是pH),以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱,分析柱是键合硅胶时,预柱为硅胶,可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”,避免分析柱中的硅胶基质被溶解,压力升高是需要更换预柱的信号。

5 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处 理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

6 经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时,对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡,每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右,即常规分析需要50~75ml。

7.避免使用高粘度的溶剂作为流动相;如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净

8进样样品要提纯;

9严格控制进样量; 不要超载

10 每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱,最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗,例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时,使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道,不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用,应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

11大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围

12 按说明书保存色谱柱,绝对禁止讲缓冲液留在柱内过夜,注意反相柱不能用纯水长时间冲

13 不建议拆开柱子,自己更换填料

一般来说,所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加,经常最后一个溶剂是非常疏水的(如醋酸乙酯甚至是烃),可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。清洗过程要结束时,必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。例如,异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂,因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大,必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然,如果使用紫外检测器的话,避免溶剂在紫外区域有吸收,要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。

当拿到一根新色谱柱时,请搞先仔细阅读其说明书和质检报告,并按报告说明进行验证,

以下参数必须清楚:

填料类型(C18,3μm,全多孔型,含炭量,100A,)    

色谱柱规格(250×4.6)

柱子出厂保存在何种溶液,是否平衡过,否则需要在使用前以低流速平衡过夜

当色谱柱使用一段时间,柱效下降的很厉害时

请根据下表选择您的再生方法: 极性固定相(如Si,NH2*,DIOL基色谱填料)的再生: 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的再生: 水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能成铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 **如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死

(请按说明书的规定,采用相应的溶剂。)

还有一个问题是清洗过程中是否可以把HPLC柱子反过来。因为大多数强保留的污染物都会累积在柱头,把柱子反过来可以缩短污染物被冲出柱子的移动距离。考虑到装填柱子的稳定性,现在大多数HPLC柱子都是比普通操作压力大很多的高压装填的,因此他们的柱床应该不会受到反方向流速的影响。但是,如果头上的烧结比尾部的烧结孔径大的话。例如尾部烧结的孔径是2μm,他通常能够留住平均5μm孔径里的填料。有时侯厂家会让头部孔径较大以避免样品或流动相颗粒堵塞。如果这种孔径大于装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时,有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱,这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志建议的流动方向,我建议通过操作手册和说明书,厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。无论你是否把柱子反方向,最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池,否则有可能引起污染。

对于反相柱子,不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)和三硝基甲苯,因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除去。用表面活性剂会影响装填表面而改变其性质。

如果样品含有离子化合物,变化pH可以使他们转为非离子状态,这样他们就可以被水-有机溶剂混合物洗脱下来。例如,强碱性物质能在pH低于3时被除去,在这个条件下质子铵变得水溶性更好。酸性物质能在pH调整到大于其pKa时被洗下来--大约时pH8或9,这个状态酸性物质处于离子状态。然而,要注意硅胶柱子在长时间处于高pH条件下容易被破坏。

色谱工作者经常会讨论到离子对色谱中离子对试剂对固定相的影响。显然离子对试剂如辛烷-磺酸(用于阳离子)和四烷基铵溴(用于阴离子)在一定浓度的有机修饰剂下能很强地吸附在硅胶键合柱子上。柱子因此被污染很难回复到起始状态,因此人们都认为任何用于离子对的柱子都会被破坏而且用于不能再用于普通的反相色谱。

Bidlingmeyer不同意这种观点,他认为用于离子对色谱苛刻的pH值会通过水解键合相和在酸性条件下(pH1-3)硬化硅胶或在高pH条件下(pH7-8)溶解硅胶使一些柱子的性质改变。要清除离子对试剂中的磺酸,他建议首先用相同的没有离子对的缓冲液(至少20体积)冲洗然后用没有缓冲液的流动相(在清洗过程中甲醇可能比乙晴更有效;如果是长链的离子对试剂,用四氢呋喃)。很明显,磺酸离子对试剂和铵离子对试剂有着不同的表现。Bidlingmeyer和他的合作者证明了在C18柱子上用流动相浓度大于70%的甲醇,长链离子对试剂,SDS不会吸附在固定相上。这个发现跟分离组的结果一致。硅胶键合整体柱如Chromolith 柱子(默克公司,德国)可认为跟别的硅胶柱一样。

色谱柱中的流动相会排干吗?      不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形:不慎未及时补充流动相,泵将溶剂瓶中的流动相吸干了,HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱?泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了?色谱柱还能使用吗?

事实上,如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干,并不会造成色谱柱的损坏。

即使泵中充满了空气,泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体,

而不能输送空气。相比之下,另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱

两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样,整个色谱柱干涸的情况

不太容易发生,多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了,因挥发掉所

有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了,也不一定

就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂(如

经氦气脱气的甲醇)冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润

填料表面;已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱

大约需要(以1mL/min的流速)冲一个小时或更多的时间被彻底浸润,恢复到正常状态。

既然谈柱子,那也谈谈填料

固定相

基质(担体)

HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质,也可以是有机聚合物基质。无机物基质主要是硅胶和氧化铝。无机物基质刚性大,在溶剂中不容易膨胀。有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩,溶剂或溶质容易渗入有机基质中,导致填料颗粒膨胀,结果减少传质,最终使柱效降低。

硅胶

硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外,还提供一个表面,可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基,制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。通常,硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。

硅胶的主要性能参数有:

①平均粒度及其分布。

②平均孔径及其分布。与比表面积成反比。

③比表面积。在液固吸附色谱法中,硅胶的比表面积越大,溶质的k值越大。

④含碳量及表面覆盖度(率)。在反相色谱法中,含碳量越大,溶质的k值越大。

⑤含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中,硅胶的含水量越小,其表面硅醇基的活性越强,对溶质的吸附作用越大。

⑥端基封尾。在反相色谱法中,主要影响碱性化合物的峰形。

⑦几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶,前者价格较便宜,

缺点是涡流扩散项及柱渗透性差;后者无此缺点。

⑧硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶,柱效高,寿命长,碱性成份不拖尾

硅胶的表面结构

表面积

硅胶的比表面积(每克硅胶的表面积)与孔径大小成反比。

表面活性

表面活性取决于硅胶表面含有的硅羟基。

游离硅羟基:活性最高

氢化硅羟基:活性有所降低

硅氧环:活性很弱

活性的调节:在硅胶中加入一定量水,利用物理吸附水降低活性。

1.1.2 氧化铝

具有与硅胶相同的良好物理性质,也能耐较大的pH范围。它也是刚性的,不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是,氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相,并显示出优秀的pH稳定性。

1.1.3 聚合物

以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC,它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相,在整个pH范围内稳定,可以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强,但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯那样耐酸碱,但也可以承受在pH13下反复冲洗。

所有聚合物基质在流动相发生变化时都会出现膨胀或收缩。用于HPLC的高交联度聚合物填料,其膨胀和收缩要有限制。溶剂或小分子容易渗入聚合物基质中,因为小分子在聚合物基质中的传质比在陶瓷性基质中慢,所以造成小分子在这种基质中柱效低。对于大分子像蛋白质或合成的高聚物,聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此,聚合物基质广泛用于分离大分子物质。

1. 1.4 基质的选择

硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析,尤其是小分子量的被分析物,

聚合物填料用于大分子量的被分析物质,主要用来制成分子排阻和离子交换柱。

  硅胶  氧化铝  苯乙烯-二乙烯苯  甲基丙烯酸酯

耐有机溶剂  +++  +++  ++  ++

适用pH范围  +  ++  +++  ++

抗膨胀/收缩  +++  +++  +  +

耐压  +++  +++  ++  +

表面化学性质  +++  +  ++  +++

效能  +++  ++  +  +

化学键合固定相

将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗,并且可以通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。

目前,化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基体,用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面的游离硅醇基反应,形成Si-O-Si-C键形的单分子膜而制得。硅胶表面的硅醇基密度约为5个/nm2,由于空间位阻效应(不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上)和其它因素的影响,使得大约有40~50%的硅醇基未反应。

残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响,特别是对非极性键合相,它可以

减小键合相表面的疏水性,对极性溶质(特别是碱性化合物)产生次级化学吸附,从而使保留机制复杂化(使溶质在两相间的平衡速度减慢,降低了键合相填料的稳定性。结果使碱性组分的峰形拖尾)。为尽量减少残余硅醇基,一般在键合反应后,要用三甲基氯硅烷(TMCS)等进行钝化处理,称封端(或称封尾、封顶,end-capping),以提高键合相的稳定性。另一方面,也有些ODS填料是不封尾的,以使其与水系流动相有更好的“湿润”性能。

由于不同生产厂家所用的硅胶、硅烷化试剂和反应条件不同,因此具有相同

键合基团的键合相,其表面有机官能团的键合量往往差别很大,使其产品性能有很大的不同。键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示,也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。

pH值对以硅胶为基质的键合相的稳定性有很大的影响,一般来说,硅胶键合相应在pH=2~8的介质中使用。

键合相的种类

化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。

常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。

极性键合相常用作正相色谱,混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用,极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。

常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基等,以C18应用最广。非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响,一般来说,样品容量随烷基链长增加而增大,且长链烷基可使溶质的保留值增大,并常常可改善分离的选择性;但短链烷基键合相具有较高的覆盖度,分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。

另外C18柱稳定性较高,这是由于长的烷基链保护了硅胶基质的缘故,但C18基团空间体积较大,使有效孔径变小,分离大分子化合物时柱效较低。

固定相的选择

分离中等极性和极性较强的化合物可选择极性键合相。氰基键合相对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好的选择性。氨基键合相具有较强的氢键结合能力,对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力;氨基键合相上的氨基能与糖类分子中的羟基产生选择性相互作用,故被广泛用于糖类的分析,但它不能用于分离羰基化合物,如甾酮、还原糖等,因为它们之间会发生反应生成Schiff 碱。二醇基键合相适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。

分离非极性和极性较弱的化合物可选择非极性键合相。利用特殊的反相色谱技术,例如反相离子抑制技术和反相离子对色谱法等,非极性键合相也可用于分离离子型或可离子化的化合物。ODS(octadecyl silane)是应用最为广泛的非极性键合相,它对各种类型的化合物都有很强的适应能力。短链烷基键合相能用于极性化合物的分离,而苯基键合相适用于分离芳香化合物。

另外,美国药典对色谱法规定较严,它规定了柱的长度,填料的种类和粒度,

填料分类也较详细,这样使色谱图易于重现;而中国药典仅规定填料种类,未规定柱的长度和粒度,这使检验人员难于重现实验,在某些情况下还浪费时间和试剂。

固定相的结构

50μm

large porous particles

大孔填料

30μm

2μm active surface

pellicular beads

表面多孔型薄壳玻璃珠

3-10μm

Microparticulates

全多孔型硅胶微粒填料

50μm填料的缺点:机械强度低,传质阻力大,柱效低

30μm填料的缺点:比表面积小,吸附不充分,分离度不好

3-10μm填料最常使用

如果表面硅羟基键合不完全,会有二次保留效应,使得峰形发生扩展,所以

对裸露的硅羟基要实行封端(封尾)技术。

常见的封尾技术:

1.空间位阻:甲基换成异丁基

2.双封端法:用C18和甲基同时封端

3其他技术

在甲醇中,毛(C18 )处于树立状态,而在纯水中,毛处于蜷缩,倒立状态,长期用纯水冲柱子,键合相容易损伤,所以建议用5-10%甲醇的水溶液替代纯水洗柱子(缓冲盐)

当小孔径、端基封口良好的反相填料色谱柱使用接近100%的水为流动相时,有时会发生分离突然丧失及被分析物质保留明显降低或完全不保留的现象,这就是疏水坍塌。此现象是由流动相不浸润固定相表面而致。挽救的办法实现用含大量有机组分的流动相浸润固定相,再用高水含量的流动相进行平衡。由是色谱柱长期储存也会发生此现象。使用内嵌极性基团的反相色谱柱(如Waters SymmetryShield RP色谱柱)或非端基封口的色谱柱(如Waters Resolve色谱柱)也可避免发生坍塌。

最常使用的全孔微粒硅胶(3~10μm)是化学键合相硅胶,这种固定相要占所有柱填料的80%。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团(例如各种有机硅烷),键合到硅胶表面上,取代了羟基(-OH)而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。

使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是 2~7.5,若过碱(>pH8),硅胶会粉碎或溶解;若过酸(<pH1),键合相的化学键会断裂。有些特殊的健合相可以用于pH 9~11。

正相色谱原理

极性固定相

有机流动相

传统

硅胶

氧化铝

目前

氰基

氨基

二醇基

适用于

同分异构体的分离

在有机/水流动相中不溶化合物的分离

适用于中等极性化合物的分离

机理

H键

偶极矩

П键

溶质顶替等量的溶剂

被分析物极性过大时,样品会在吸附柱中会被永久的吸附保留,毁坏柱子

硅胶柱和氧化铝柱的缺点:

容易脱尾

样品被催化分解

不易剃度洗脱

含水量要控制

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